IFT172 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404379-ACT

IFT172 kodiert eine Komponente des intraflagellären Transports (IFT) des Komplexes B, die für den anterograden Transport innerhalb primärer Zilien essenziell ist und damit den Aufbau des Axonems, die Aufrechterhaltung der Zilienstruktur sowie die Signaltransduktion unterstützt. Indem IFT172 die Bewegung ziliärer Fracht ermöglicht, beeinflusst es zilienabhängige Entwicklungs- und Homöostasewege, darunter das Hedgehog-Signalwege sowie weitere rezeptorvermittelte Prozesse, die auf eine intakte Zilienarchitektur angewiesen sind. Eine Störung oder Fehlregulation von IFT172 ist mit ciliopathieassoziierten Phänotypen verbunden und verknüpft veränderten Zilientransport mit Defekten in Gewebemusterung, Sinnesfunktionen und Organentwicklung. Als Faktor des ziliären Transports wird IFT172 häufig eingesetzt, um Mechanismen der Ziliogenese, die Dynamik zilienvermittelter Signalübertragung und Genotyp‑Phänotyp‑Zusammenhänge in humanen Zellmodellen zu untersuchen.

IFT172 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IFT172-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IFT172 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IFT172-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IFT172-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IFT172-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IFT172-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IFT172-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IFT172-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IFT172-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.