IDH2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401417-ACT

IDH2 kodiert die mitochondriale, NADP+-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase, die die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu α‑Ketoglutarat katalysiert und dabei NADPH erzeugt. Diese Aktivität unterstützt die mitochondriale Redox-Homöostase, speist antioxidative Abwehrmechanismen und verbindet den Tricarbonsäurezyklus über α‑Ketoglutarat‑abhängige Dioxygenasen mit zellulärer Biosynthese und epigenetischer Regulation. Eine veränderte IDH2-Funktion kann den Stoffwechsel und die Redox-Signalgebung neu verdrahten und so Differenzierungszustände sowie Stressantworten in unterschiedlichen Zelltypen beeinflussen. Wiederkehrende Störungen von IDH2 werden im Hinblick auf ihre Rolle bei der onkogenen metabolischen Umprogrammierung und die nachgeschalteten Effekte auf Chromatin und Transkriptionsprogramme untersucht.

IDH2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IDH2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IDH2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IDH2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IDH2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IDH2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IDH2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IDH2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IDH2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IDH2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.