Plasmide CRISPR d'Activation (h) ICMT: sc-406029-ACT

L’ICMT humaine (isoprenylcysteine carboxyl methyltransférase) est une enzyme localisée dans le réticulum endoplasmique qui catalyse la méthylestérification des prénnylcystéines C-terminales des protéines portant un motif CAAX, après la prénnylation et la protéolyse. Cette étape de maturation post-prénnylation module l’affinité membranaire, le trafic sous-cellulaire et la sortie de signalisation de multiples substrats prénnylés, notamment de petites GTPases impliquées dans les voies des facteurs de croissance et de réponse au stress. En façonnant la localisation et la fonction des protéines de signalisation prénnylées, l’ICMT relie les réseaux de modifications lipidiques à la régulation de la prolifération, de la différenciation et de la dynamique du cytosquelette. Une signalisation dépendante de la prénnylation dérégulée a été associée à la transformation oncogénique et à d’autres troubles de la signalisation cellulaire et de la mauvaise localisation des protéines, ce qui fait de l’ICMT un nœud utile pour les études mécanistiques.

ICMT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ICMT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ICMT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ICMT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ICMT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ICMT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ICMT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ICMT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ICMT dans les cellules tumorales présentant une expression de ICMT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.