iASPP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404703-ACT

Das humane PPP1R13L-Gen kodiert iASPP, ein regulatorisches Protein, das vor allem als Inhibitor von Transkriptionsfaktoren der p53-Familie bekannt ist, darunter TP53, TP63 und TP73. Durch die Modulation p53-abhängiger transkriptioneller Programme beeinflusst iASPP Apoptose, Zellzykluskontrolle und Stressantworten und ist in Signalwege eingebunden, die die Genomintegrität und das zelluläre Überleben mitbestimmen. iASPP wurde außerdem über Interaktionen, die aktin-assoziierte Signalübertragung beeinflussen, mit der Zytoskelettdynamik und der Zellmotilität in Verbindung gebracht. Eine fehlregulierte PPP1R13L/iASPP-Expression wurde in mehreren Krebskontexten beschrieben und wird hinsichtlich ihrer Rolle bei Tumorprogression, Invasion und Resistenz gegenüber zellulärem Stress untersucht.

iASPP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP1R13L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

iASPP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP1R13L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP1R13L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen iASPP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP1R13L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von iASPP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des iASPP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP1R13L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.