HYPB CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402789-ACT

SETD2 (HYPB) kodiert eine Histonmethyltransferase mit SET-Domäne, die die Trimethylierung von Histon H3 an Lysin 36 (H3K36me3) über aktiv transkribierten Genkörpern katalysiert. Diese Chromatinmarke koordiniert die Transkriptionselongation mit dem pre‑mRNA‑Spleißen, der DNA-Schadensreparatur und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität, indem sie H3K36me3‑„Reader“-Komplexe rekrutiert. Die SETD2-Aktivität beeinflusst außerdem die DNA-Mismatch-Reparatur und homologe Rekombinationswege und verknüpft so epigenetische Regulation mit der Replikationstreue. Eine Störung oder Fehlregulation der SETD2-abhängigen H3K36-Methylierung ist mit veränderten Chromatinzuständen, fehlerhafter Transkriptionsregulation und Genominstabilität verbunden, wie sie in zahlreichen Krebs- und entwicklungsbedingten Krankheitskontexten beobachtet werden.

HYPB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SETD2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HYPB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SETD2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SETD2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HYPB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SETD2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HYPB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HYPB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SETD2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.