HYAL4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409245-ACT

Das humane HYAL4 codiert ein Enzym aus der Hyaluronidase-Familie, das am Umsatz von Glykosaminoglykanen der extrazellulären Matrix beteiligt ist und dadurch das Remodeling hyaluronanreicher Mikroumgebungen beeinflusst. Durch die Modulation der perizellulären Matrixzusammensetzung kann HYAL4 Zell–Matrix-Interaktionen, Migration sowie Signaloutputs beeinflussen, die mit Adhäsion und Entzündungsreaktionen verknüpft sind. Ein veränderter Hyaluronan-Stoffwechsel wurde mit Gewebefibrose, Tumor–Stroma-Dynamiken und dem Trafficking von Immunzellen in Verbindung gebracht, wodurch die HYAL4-Expression in krankheitskontextbezogenen Modellen eine relevante Variable darstellt. Die Untersuchung der Regulation und Funktion von HYAL4 trägt dazu bei zu klären, wie der Glykankatabolismus in die Homöostase der extrazellulären Matrix und das Zellverhalten integriert ist.

HYAL4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HYAL4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HYAL4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HYAL4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HYAL4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HYAL4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HYAL4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HYAL4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HYAL4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HYAL4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.