Plasmide CRISPR d'Activation (h) HXK III: sc-403846-ACT

Le gène humain HK3 code l’hexokinase III (HXK III), une enzyme phosphorylant le glucose qui catalyse la conversion du glucose en glucose-6-phosphate, dépendante de l’ATP, engageant ainsi les substrats hexoses dans le métabolisme intracellulaire. En générant du glucose-6-phosphate, HXK III contribue à réguler le flux glycolytique et favorise l’orientation vers la voie des pentoses phosphates pour la production de NADPH et le maintien de l’homéostasie rédox. L’expression de HK3 est fréquemment étudiée dans des contextes immunitaires et hématopoïétiques, où la reprogrammation métabolique façonne la signalisation inflammatoire, la différenciation et les réponses au stress. Une activité d’hexokinase dérégulée et une transcription altérée de HK3 ont été associées à des phénotypes métaboliques pertinents pour la maladie, notamment une utilisation anormale du glucose et des voies liées au stress oxydatif.

HXK III Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HK3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HXK III Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HK3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HK3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HXK III. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HK3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HXK III au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HXK III dans les cellules tumorales présentant une expression de HK3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.