Hus1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403287-ACT

O gene HUS1 humano codifica a proteína Hus1, um componente central do grampo de checkpoint 9-1-1 (RAD9A–RAD1–HUS1), que é carregado no DNA danificado para coordenar a vigilância do genoma. Esse complexo promove a sinalização dependente de ATR, auxilia na estabilização das forquilhas de replicação e facilita a escolha das vias de reparo do DNA por meio de interações com mediadores como TOPBP1 e diversos fatores de reparo. Ao conectar a detecção de dano no DNA ao controle do checkpoint do ciclo celular, Hus1 ajuda a limitar a instabilidade genômica associada à replicação. A desregulação dos processos de checkpoint 9-1-1/ATR é frequentemente estudada no contexto de carga mutacional, fenótipos de instabilidade cromossômica e defeitos na resposta a danos no DNA relevantes para a biologia do câncer e para doenças hereditárias de manutenção do genoma.

Hus1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HUS1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Hus1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HUS1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HUS1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Hus1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HUS1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Hus1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Hus1 em células tumorais com expressão de HUS1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.