HuR/ELAV1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421003-ACT

Elavl1 kodiert HuR/ELAV1, ein RNA-bindendes Protein, das AU-reiche Elemente in den 3′-UTRs erkennt und die Stabilität, Lokalisation und Translation von mRNA moduliert. In Mauszellen koordiniert HuR posttranskriptionelle Programme der Genregulation, die mit Zellzykluskontrolle, Stressantworten, angeborener Immun-Signalgebung und Differenzierung verknüpft sind, indem es die Halbwertszeit von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und überlebensassoziierten Transkripten beeinflusst. Die HuR-Aktivität wird dynamisch durch Phosphorylierung und nukleo-zytoplasmatisches Shuttling reguliert und integriert MAPK-, PKC- und weitere Signalinputs, um Genexpressionsausgänge fein abzustimmen. Fehlregulierte HuR-abhängige RNA-Regulons wurden in der Literatur mit Entzündungen, onkogener Transformation und Gewebeumbau in Verbindung gebracht, was Elavl1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien des RNA-Stoffwechsels und des Signalweg-Crosstalks macht.

HuR/ELAV1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Elavl1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HuR/ELAV1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Elavl1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Elavl1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HuR/ELAV1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Elavl1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HuR/ELAV1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HuR/ELAV1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Elavl1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.