Plásmido CRISPR de Activación (h) HSPA6: sc-400870-ACT

HSPA6 codifica un miembro inducible por estrés de la familia HSP70 que funciona como chaperona molecular dependiente de ATP para estabilizar proteínas nacientes o dañadas, favorecer su replegamiento y prevenir su agregación durante el estrés proteotóxico. Se sobreexpresa rápidamente en respuesta al choque térmico y a otras agresiones celulares mediante programas transcripcionales mediados por factores de choque térmico, y participa en redes de proteostasis que se conectan con la respuesta a proteínas mal plegadas, el recambio por el sistema ubiquitina–proteasoma y la autofagia. Al modular la capacidad de control de calidad proteica, los cambios en la expresión de HSPA6 se analizan con frecuencia en contextos de estrés oxidativo, inflamación y daño celular. La actividad de chaperonas desregulada y la proteostasis alterada son relevantes de forma amplia para la neurodegeneración, la adaptación al estrés en células cancerosas y modelos de daño tisular, lo que convierte a HSPA6 en un marcador útil y un modulador en estudios de biología del estrés.

HSPA6 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HSPA6 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HSPA6 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HSPA6 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HSPA6, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HSPA6. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HSPA6 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HSPA6 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HSPA6 en células tumorales con expresión de HSPA6 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.