HSPA5/BiP/GRP78 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420699-ACT

Das murine Gen **Hspa5** codiert für **HSPA5 (BiP/GRP78)**, ein Chaperon der **HSP70-Familie** im **endoplasmatischen Retikulum (ER)**, das an neu synthetisierte Polypeptide bindet, die Proteinfaltung und -assemblierung unterstützt und die **Ca²⁺-Homöostase** des ER reguliert. HSPA5 ist ein zentraler Sensor und Effektor der **Antwort auf fehlgefaltete Proteine (unfolded protein response, UPR)** und koordiniert die ER-Stress-Signalweiterleitung über **PERK–EIF2α**, **IRE1–XBP1** und **ATF6**, um die Proteostase wiederherzustellen oder bei anhaltendem Stress Apoptose zu initiieren. Über seine Funktionen in der **ER-assoziierten Degradation (ERAD)**, der Reifung des sekretorischen Wegs und der Qualitätskontrolle beeinflusst HSPA5 den zellulären Stoffwechsel, das Redox-Gleichgewicht und entzündliche Signalwege. Eine fehlregulierte HSPA5/UPR-Aktivität wird in Kontexten wie Neurodegeneration, metabolischem Stress und Tumorbiologie umfassend untersucht, da veränderte Proteostase und Anpassung an ER-Stress das Zellüberleben und Immuninteraktionen prägen.

HSPA5/BiP/GRP78 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Hspa5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HSPA5/BiP/GRP78 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Hspa5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Hspa5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HSPA5/BiP/GRP78-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Hspa5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HSPA5/BiP/GRP78-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HSPA5/BiP/GRP78-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Hspa5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.