Plasmide CRISPR d'Activation (h) HSP70-1: sc-418088-ACT

HSPA1A code la chaperonne moléculaire inductible HSP70-1, un composant central de la réponse cellulaire au choc thermique qui préserve la protéostase lors de stress thermiques, oxydatifs et protéotoxiques. HSP70-1 se lie aux régions hydrophobes exposées des protéines naissantes ou mal repliées afin de favoriser leur repliement, d’empêcher leur agrégation et de coordonner les décisions de tri avec des co‑chaperonnes ainsi qu’avec les voies ubiquitine‑protéasome et d’autophagie. Ce réseau adaptatif au stress recoupe le contrôle qualité des protéines, la régulation de l’apoptose, la signalisation inflammatoire et la récupération après un stress du réticulum endoplasmique et des mitochondries. Une expression dérégulée de HSPA1A/HSP70-1 est fréquemment étudiée dans le contexte des maladies liées au mauvais repliement des protéines, des lésions d’ischémie‑reperfusion et de la tolérance au stress des cellules tumorales, où une capacité de chaperonnage modifiée peut remodeler la résilience cellulaire et les états de signalisation.

HSP70-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HSPA1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HSP70-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HSPA1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HSPA1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HSP70-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HSPA1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HSP70-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HSP70-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de HSPA1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.