HSP 20 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403164-ACT

HSPB6 kodiert das kleine Hitzeschockprotein HSP20, ein stressinduzierbares molekulares Chaperon, das die Proteinfaltung, die Zytoskelettdynamik und die Proteostase moduliert. In glatter Muskulatur und kardiovaskulären Zelltypen ist HSP20 an Signalprogrammen beteiligt, die mit cAMP/PKA- sowie Stickstoffmonoxid–cGMP‑Signalwegen verknüpft sind, wobei phosphorylationabhängige Effekte auf den Aktin-Umbau und den Kontraktionstonus auftreten. HSP20 greift außerdem in Apoptose- und oxidativen Stressantworten ein und beeinflusst so das Zellüberleben unter proteotoxischen und entzündlichen Bedingungen. Eine fehlregulierte HSPB6-Expression oder -Signalgebung wurde mit veränderter Gefäßreaktivität, der Stressadaptation von Kardiomyozyten und einer Dysfunktion glatter Muskulatur in Verbindung gebracht, was es für mechanistische Studien der kardiovaskulären und der Atemwegsbiologie relevant macht.

HSP 20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSPB6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HSP 20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSPB6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSPB6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HSP 20-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSPB6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HSP 20-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HSP 20-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSPB6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.