Plásmido Doble Nickase (m2) HPRT: sc-420943-NIC-2

El gen Hprt de ratón codifica la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT), una enzima clave de la vía de rescate de purinas que cataliza la conversión de hipoxantina y guanina en IMP y GMP utilizando PRPP, contribuyendo así a la homeostasis de nucleótidos y limitando la demanda de síntesis de purinas de novo. La actividad de HPRT influye en la proliferación celular y en las respuestas al estrés metabólico mediante la regulación de los reservorios de purinas, y se utiliza comúnmente en la selección con HAT y en ensayos de resistencia a 6-tioguanina para evaluar la función de la vía de rescate y la mutagénesis. La alteración de la función de HPRT se asocia con una desregulación del metabolismo de purinas y se emplea ampliamente como locus de referencia para estudiar respuestas al daño del ADN, resultados de edición genómica y contribuciones metabólicas a fenotipos neuroconductuales y hematopoyéticos en modelos murinos. Como gen constitutivo ligado al cromosoma X, Hprt también sirve como una referencia sólida para la normalización de la expresión y como marcador de selección/contraselección en flujos de trabajo de ingeniería celular en mamíferos.

HPRT El plásmido de doble nicasa (m2) consiste en un par de plásmidos emparejados diseñados para la edición de alta especificidad del locus Hprt en líneas celulares mouse. Cada plásmido expresa una nicasa Cas9 D10A y un ARN guía específico (sgRNA) dirigido a cadenas de ADN opuestas dentro de Hprt. Cuando se dirigen a sitios adyacentes en cadenas de ADN opuestas, las dos nicasas generan cortes en cadena simple desplazados que, juntos, producen una rotura de doble cadena escalonada, lo que requiere una actividad coordinada sobre el objetivo por parte de ambas guías. La rotura de ADN resultante se resuelve mediante vías de reparación celular endógenas, más comúnmente a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ), lo que da lugar a inserciones o deleciones que alteran la función de Hprt. Al requerir la participación de dos ARN guía en el locus diana, el enfoque de doble corte mejora la especificidad de la edición y proporciona una estrategia CRISPR complementaria para aplicaciones en las que se desea un control adicional sobre la precisión de la orientación.

Para facilitar la identificación eficiente de las células editadas, un plásmido codifica GFP para la visualización fluorescente de las poblaciones transfectadas, mientras que el plásmido complementario lleva un gen de resistencia a la puromicina para la selección con antibióticos. En conjunto, estas características facilitan el enriquecimiento eficiente de las poblaciones cotransfectadas y simplifican la validación de los clones con Hprt alterado.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.