HPRT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417332-ACT

HPRT1 kodiert die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT), ein Schlüsselenzym des Purin-„Salvage“-Stoffwechselwegs, das unter Verwendung von PRPP die Umwandlung von Hypoxanthin und Guanin zu IMP bzw. GMP katalysiert. Durch die Aufrechterhaltung der Homöostase des Nukleotidpools unterstützt HPRT die DNA-/RNA-Synthese und beeinflusst zelluläre Antworten auf metabolischen Stress und Replikationsbedarf. Die Aktivität von HPRT1 ist zentral für den Purinstoffwechsel, steht in Wechselwirkung mit PRPP-abhängigem biosynthetischem Stofffluss und wird in der Säugetierzellgenetik häufig als Selektionsmarker-Lokus genutzt. Loss-of-Function-Varianten in HPRT1 stören das Purinrecycling und sind mit angeborenen Stoffwechselstörungen sowie neurobehavioralen Phänotypen assoziiert, wodurch sich ein gut handhabbares Modell zur Untersuchung metabolischer Regulation und von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen ergibt.

HPRT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HPRT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HPRT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HPRT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HPRT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HPRT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HPRT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HPRT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HPRT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HPRT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.