HoxA11 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-405264-ACT-2

Das humane Gen HOXA11 kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor HoxA11, einen DNA-bindenden Regulator, der während der Embryogenese zur Festlegung der anterior-posterioren Musterbildung und der regionalen Identität beiträgt und zudem Differenzierungsprogramme in mesenchymalen Zelllinien sowie in Linien des Reproduktionstrakts unterstützt. HoxA11 moduliert die Genexpression durch Erkennung von Homeobox-Motiven und durch kofaktorabhängige transkriptionelle Kontrolle und ist dabei in entwicklungsbiologische Signalnetzwerke eingebunden, die Morphogenese, Gewebeumbau und Entscheidungen über das Zellschicksal steuern. Eine fehlregulierte HOXA11-Expression oder epigenetische Veränderungen wurden mit angeborenen Fehlbildungen und Krebserkrankungen in Verbindung gebracht, bei denen aberrante HOX-Genprogramme veränderte Differenzierungs- und Proliferationszustände fördern. Auf HOXA11 ausgerichtete Geneditierung und funktionelle Genomik-Assays werden eingesetzt, um cis-regulatorische Elemente zu kartieren, nachgeschaltete transkriptionelle Schaltkreise zu definieren und entwicklungs- sowie krankheitsrelevante Phänotypen in humanen Zellmodellen zu untersuchen.

HoxA11 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HOXA11-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HoxA11 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HOXA11-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HOXA11-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HoxA11-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HOXA11-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HoxA11-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HoxA11-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HOXA11-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.