HNF-4α CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420892-ACT

Hnf4a kodiert den hepatozytären nukleären Faktor 4 alpha (HNF-4α), einen ligandenregulierten nukleären Rezeptor-Transkriptionsfaktor, der epitheliale und metabolische Genprogramme in Leber, Darm, Pankreas und Niere koordiniert. HNF-4α bindet an spezifische DNA-Antwortelemente, um Netzwerke zu regulieren, die die Lipid- und Glukosehomöostase, den Gallensäurestoffwechsel, die Entgiftung von Xenobiotika und die epitheliale Differenzierung steuern, und ist dabei in Signalwege eingebunden, zu denen unter anderem die PPAR-Signalgebung und Schaltkreise der Hepatozytenreifung gehören. In Mausmodellen ist eine veränderte Hnf4a-Aktivität mit gestörter Leberfunktion, beeinträchtigter Darmbarriere sowie absorptiven Programmen und einer weiter gefassten metabolischen Dysregulation verknüpft, was Hnf4a zu einem zentralen Knotenpunkt für Studien zur Gewebeidentität und homöostatischen Kontrolle macht.

HNF-4α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Hnf4a-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HNF-4α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Hnf4a-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Hnf4a-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HNF-4α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Hnf4a-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HNF-4α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HNF-4α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Hnf4a-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.