HLA-B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400627-ACT

HLA-B codifica uma cadeia pesada polimórfica do MHC de classe I que se associa à β2-microglobulina para apresentar aos linfócitos T CD8+ peptídeos derivados do interior da célula, moldando a vigilância imunitária e as respostas citotóxicas. A sua expressão é rigidamente regulada por sinalização induzida por interferões e pelas vias de processamento e apresentação de antigénios, incluindo a geração de peptídeos pelo proteassoma e o transporte de peptídeos para o retículo endoplasmático mediado por TAP. A variação em HLA-B influencia o repertório de peptídeos e modula o alorreconhecimento e as interações hospedeiro–patógeno, associando este locus à suscetibilidade a doenças imunomediadas e à compatibilidade em transplantes. Alterações na expressão de HLA-B ou no uso de alelos também são relevantes em estudos de evasão imunitária e de microambientes inflamatórios, nos quais a apresentação de antigénios é remodelada de forma dinâmica.

HLA-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HLA-B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HLA-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HLA-B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HLA-B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HLA-B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HLA-B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HLA-B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HLA-B em células tumorais com expressão de HLA-B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.