HIG2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403510-ACT

O HILPDA humano codifica a proteína associada a gotículas lipídicas induzível por hipóxia (HIG2), um pequeno fator de resposta ao estresse que se localiza em gotículas lipídicas e se conecta à remodelação metabólica em condições de baixo oxigênio e limitação de nutrientes. A HIG2 é induzida a jusante da sinalização de HIF e contribui para a regulação do armazenamento e do uso de lipídios intracelulares, influenciando o controle da lipólise e o manejo de ácidos graxos durante a adaptação à hipóxia. Por meio desses processos, HILPDA/HIG2 é relevante para vias que ligam hipóxia, metabolismo lipídico e respostas inflamatórias ou de estresse metabólico. A expressão desregulada tem sido associada a condições caracterizadas por tensão de oxigênio alterada e reprogramação lipídica, o que sustenta seu uso como um nó mecanístico para estudar fenótipos metabólicos relevantes para doenças.

HIG2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HILPDA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HIG2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HILPDA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HILPDA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HIG2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HILPDA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HIG2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HIG2 em células tumorais com expressão de HILPDA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.