HIF PHD3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403671-ACT

EGLN3 kodiert die HIF‑Prolylhydroxylase 3 (PHD3), eine sauerstoffsensitive Dioxygenase, die HIF‑α‑Untereinheiten hydroxiliert und dadurch unter Normoxie die VHL‑abhängige Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau fördert. Durch die Feinabstimmung der HIF‑Transkriptionsaktivität beeinflusst PHD3 die zelluläre Anpassung an Hypoxie, einschließlich glykolytischem Stoffwechsel, angiogener Signalgebung, erythropoesebezogener Programme und Reaktionen auf oxidativen Stress. Die EGLN3‑Expression wird dynamisch durch Hypoxie und andere Stresssignale reguliert, was sie mit der Feedback‑Kontrolle innerhalb des HIF‑Signalwegs sowie mit breiteren Netzwerken der Redox‑ und mitochondrialen Homöostase verknüpft. Eine dysregulierte EGLN3/PHD3‑Aktivität und HIF‑Signalgebung werden häufig im Kontext der Tumorbiologie, ischämieassoziiertem Gewebestress, Entzündung und neurodegenerativen Prozessen untersucht, bei denen eine sauerstoffabhängige transkriptionelle Umprogrammierung ein zentraler Treiber des Phänotyps ist.

HIF PHD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EGLN3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HIF PHD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EGLN3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EGLN3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HIF PHD3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EGLN3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HIF PHD3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HIF PHD3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EGLN3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.