HES4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408938-ACT

O HES4 humano codifica um represssor transcricional do tipo hélice–alça–hélice básica (bHLH) da família Hairy/Enhancer-of-split, que atua como um efetor a jusante da sinalização canônica de Notch. Ao se ligar a motivos semelhantes a E-box e recrutar complexos correpressores, o HES4 modula programas transcricionais que controlam decisões de destino celular, o timing da diferenciação e a manutenção de estados semelhantes aos de progenitores. A atividade do HES4 está associada a processos de desenvolvimento e especificação de linhagens e interage com vias que regulam “stemness” e diferenciação, tornando-o relevante para estudos de desregulação do controle transcricional no câncer e em outras doenças proliferativas. Como perturbações no eixo Notch–HES podem desviar trajetórias de diferenciação e alterar a capacidade proliferativa, o HES4 é frequentemente investigado como um regulador dependente do contexto de redes de expressão gênica.

HES4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HES4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HES4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HES4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HES4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HES4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HES4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HES4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HES4 em células tumorais com expressão de HES4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.