Herc2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420831-ACT

Maus-HERC2 ist eine große E3-Ubiquitin-Ligase vom HECT-Typ, die die ubiquitinabhängige Regulation von Proteinstabilität und Signalübertragung koordiniert und dabei DNA-Schadensantworten mit der Zellzykluskontrolle verknüpft. Es ist an Prozessen der Genomstabilität beteiligt, darunter der Umgang mit Replikationsstress und die Koordination von Reparaturwegen, indem es zentrale Substrate über Ubiquitinierung moduliert. HERC2 wurde außerdem mit der Zentrosomenfunktion und der Proteostase in Verbindung gebracht und verknüpft damit Ubiquitin-Signale mit Chromatindynamik und zellulärer Homöostase. Eine Fehlregulation HERC2-assoziierter Signalwege ist für Studien zu Phänotypen genomischer Instabilität und zur neuroentwicklungsbiologischen Forschung in Säugetier-Modellsystemen relevant.

Herc2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Herc2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Herc2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Herc2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Herc2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Herc2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Herc2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Herc2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Herc2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Herc2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.