HB9 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402097-ACT

MNX1 kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor HB9, einen nukleären Regulator, der entwicklungsbezogene Genexpressionsprogramme steuert. HB9 ist vor allem dafür bekannt, die Spezifikation und Differenzierung von Motoneuronen im ventralen Rückenmark zu lenken und zu Entscheidungen der pankreatischen Zelllinien beizutragen, wobei es transkriptionelle Netzwerke beeinflusst, die Zellschicksal und Reifung regulieren. Durch sequenzspezifische DNA-Bindung ist HB9 in übergeordnete Entwicklungs-Signalwege und chromatinregulatorische Prozesse eingebunden und prägt so neuronale und endokrine Genexpressionsmuster. Eine fehlregulierte MNX1/HB9-Expression wird mit angeborenen Motoneuronerkrankungen in Verbindung gebracht und wurde zudem im Kontext hämatologischer sowie solider Tumoren beschrieben, was MNX1/HB9 zu einem nützlichen Ansatzpunkt für die Untersuchung aberranter Differenzierung und transkriptioneller Kontrolle macht.

HB9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MNX1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HB9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MNX1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MNX1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HB9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MNX1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HB9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HB9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MNX1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.