Plásmido CRISPR de Activación (m) HAI-1: sc-423128-ACT

El gen Spint1 de ratón codifica el inhibidor 1 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HAI-1), un inhibidor transmembrana de serín proteasas tipo Kunitz que limita la proteólisis pericelular al inhibir matriptasa/ST14 y proteasas relacionadas. Al restringir el procesamiento impulsado por proteasas de sustratos como el pro-HGF y otras proteínas extracelulares, HAI-1 ayuda a coordinar la integridad de la barrera epitelial, la adhesión célula–célula y la remodelación regulada de la matriz extracelular. La actividad de Spint1 se cruza con la señalización activada por proteasas y con vías de factores de crecimiento que influyen en la homeostasis epitelial, la inflamación y la reparación tisular. El desequilibrio de la relación HAI-1/proteasas se asocia con fenotipos de remodelación epitelial y con procesos de invasión vinculados a tumores, lo que convierte a Spint1 en un nodo útil para estudios mecanísticos en biología del cáncer y en biología epitelial del desarrollo.

HAI-1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Spint1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HAI-1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Spint1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Spint1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HAI-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Spint1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HAI-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HAI-1 en células tumorales con expresión de Spint1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.