HACE1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-431639-ACT

Mouse HACE1 (HECT-Domäne und Ankyrin-Repeat-enthaltende E3-Ubiquitin-Protein-Ligase 1) kodiert eine E3-Ubiquitin-Ligase, die den Proteinumsatz und die Signalübertragung reguliert, indem sie die Übertragung von Ubiquitin auf spezifische Substrate katalysiert. HACE1 wurde mit der Organisation des Zytoskeletts, dem vesikulären Transport und Stressantwort-Signalwegen in Verbindung gebracht und kann von kleinen GTPasen abhängige Prozesse beeinflussen, die Zellmigration und -adhäsion formen. Durch die Modulation der ubiquitinabhängigen Qualitätskontrolle und der Signalstärke unterstützt HACE1 die zelluläre Homöostase in Kontexten, in denen Proteostase und Redoxgleichgewicht herausgefordert sind. Eine veränderte HACE1-Aktivität wurde mit einer dysregulierten Wachstumskontrolle und Phänotypen der Genomstabilität assoziiert, was HACE1 für mechanistische Studien zu tumorsuppressorähnlichen Funktionen und zur Umprogrammierung von Signalwegen in Krankheitsmodellen relevant macht.

HACE1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Hace1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HACE1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Hace1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Hace1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HACE1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Hace1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HACE1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HACE1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Hace1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.