GTPBP10 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-413794-ACT

Humanes GTPBP10 kodiert ein mitochondriales GTP-bindendes Protein, das an der Spätphase der Mitoribosomen-Reifung beteiligt ist und den Zusammenbau der großen ribosomalen Untereinheit sowie eine effiziente mitochondriale Translation unterstützt. Durch die Regulation der Produktion von Komponenten der oxidativen Phosphorylierung, die von der mitochondrialen DNA kodiert werden, trägt GTPBP10 zur Integrität der Atmungskette, zur ATP-Generierung und zur mitochondrialen Proteostase bei. Störungen der Mitoribosomen-Biogenese und der mitochondrialen Translation werden breit mit bioenergetischen Stressantworten, einem veränderten Redoxgleichgewicht und Signalwegen der mitochondrialen Dysfunktion in Verbindung gebracht, die häufig in neuromuskulären und metabolischen Krankheitsmodellen sowie bei der Anpassung von Krebszellen untersucht werden. Daher dient GTPBP10 als nützlicher Knotenpunkt zur Untersuchung des Zusammenbaus mitochondrialer Ribosomen, der OXPHOS-Regulation und nachgeschalteter Stresssignalgebung.

GTPBP10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GTPBP10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GTPBP10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GTPBP10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GTPBP10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GTPBP10-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GTPBP10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GTPBP10-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GTPBP10-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GTPBP10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.