Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α t1}: sc-401559-ACT

GNAT1 code pour la sous-unité alpha Gαt1 (alpha de la transducine) de la protéine G hétérotrimérique, un transducteur clé du signal dans les photorécepteurs à bâtonnets qui couple la rhodopsine activée aux enzymes effectrices de la cascade de phototransduction. En réponse à la stimulation lumineuse, Gαt1 favorise l’activation de la phosphodiestérase, ce qui réduit les niveaux de GMPc, module l’activité des canaux cationiques dépendants des nucléotides cycliques et contrôle l’hyperpolarisation de la membrane. Cette voie intègre la signalisation des GPCR avec la régulation des seconds messagers afin de maintenir la sensibilité visuelle et l’adaptation en conditions de faible luminosité. La dérégulation ou l’expression altérée des composants de la phototransduction, dont GNAT1, est pertinente pour l’étude des dysfonctionnements rétiniens héréditaires et des mécanismes perturbant l’homéostasie de la signalisation des bâtonnets.

Gα t1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNAT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα t1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNAT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNAT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα t1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNAT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα t1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα t1 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNAT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.