G_{α o} CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400897-ACT

GNAO1 kodiert die menschliche alpha‑Untereinheit des heterotrimeren G‑Proteins Gαo, eine vorherrschende Komponente der Gi/o‑Familie, die zahlreiche GPCRs in neuronalen und neuroendokrinen Kontexten mit der Regulation nachgeschalteter Effektoren koppelt. Nach Rezeptoraktivierung moduliert Gαo die Second‑Messenger‑Signalübertragung, indem es die Adenylylcyclase hemmt und die Aktivität von Ionenkanälen beeinflusst; dadurch wirkt es auf synaptische Transmission, neuronale Erregbarkeit und Vesikeltransport. Die GNAO1‑abhängige Signalgebung greift in cAMP/PKA‑Signalwege sowie in umfassendere, durch GPCRs regulierte Netzwerke ein, die Zellkommunikation und Differenzierung steuern. Eine Dysregulation der GNAO1‑Expression oder ‑Funktion ist mit Phänotypen neuroentwicklungsbedingter Erkrankungen und Bewegungsstörungen assoziiert und stützt mechanistische Studien zur Balance der GPCR‑Signalübertragung in krankheitsrelevanten Zellmodellen.

Gα o Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GNAO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gα o Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GNAO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GNAO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gα o-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GNAO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gα o-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gα o-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GNAO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.