GROβ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416416-ACT

CXCL2 kodiert das wachstumsregulierte Onkogen Beta (GROβ), ein CXC-Chemokin, das hauptsächlich über CXCR2 signalisiert und während akuter Entzündungsreaktionen die Chemotaxis, Adhäsion und Aktivierung von Neutrophilen fördert. Die GROβ-Expression wird durch die Aktivität der NF-κB- und MAPK-Signalwege induziert, die nachgeschaltet an Mustererkennungsrezeptoren und proinflammatorische Zytokine liegen, und verknüpft so die angeborene Immunsensorik mit der Rekrutierung von Leukozyten. In Gewebemikroumgebungen trägt CXCL2 zur Verstärkung von Zytokin- und Chemokin-Netzwerken bei, die die Migration myeloider Zellen, angiogene Signale und den Austausch zwischen Stroma und Immunsystem prägen. Eine fehlregulierte CXCL2/GROβ-Signalgebung wird häufig bei entzündlichen Erkrankungen sowie bei tumorassoziierter Entzündung untersucht, bei der die Infiltration durch Neutrophile und myeloide Zellen krankheitsrelevante Phänotypen beeinflussen kann.

GROβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CXCL2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GROβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CXCL2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CXCL2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GROβ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CXCL2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GROβ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GROβ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CXCL2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.