Plasmide CRISPR d'Activation (m) granzyme B: sc-420745-ACT

La souris Gzmb code la granzyme B, une protéase à sérine cytotoxique stockée dans les granules lytiques des lymphocytes T CD8+ activés et des cellules NK. Lors de la formation de la synapse immunologique et après une délivrance facilitée par la perforine, la granzyme B déclenche la mort cellulaire programmée en clivant les caspases et BID, amplifiant les voies apoptotiques dépendantes des mitochondries et des caspases. Cette fonction effectrice est essentielle à la surveillance immunitaire antivirale et antitumorale, tandis qu’une activité dérégulée est associée à une immunopathologie lors d’inflammation chronique et de lésions tissulaires auto-immunes. La dynamique d’expression de Gzmb est également utilisée comme indicateur de l’état d’activation des lymphocytes cytotoxiques et de leur différenciation effectrice dans les modèles d’immunologie.

granzyme B Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Gzmb sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

granzyme B Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Gzmb dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Gzmb, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de granzyme B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Gzmb natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de granzyme B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie granzyme B dans les cellules tumorales présentant une expression de Gzmb silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.