granzyme B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401469-ACT

Das humane GZMB-Gen kodiert Granzyme B, eine trypsinähnliche Serinprotease, die in zytotoxischen Granula von CD8+-T-Zellen und NK-Zellen gespeichert ist und nach perforinabhängiger Einschleusung die Abtötung von Zielzellen vermittelt. Granzyme B spaltet zentrale Substrate, um eine caspaseabhängige Apoptose zu aktivieren, und kann zudem caspaseunabhängige Zelltodwege über mitochondriale Störungen auslösen; damit ist es mit Immun-Effektorprogrammen nach Antigenerkennung und inflammatorischer Signalübertragung verknüpft. Eine dysregulierte GZMB-Expression und -Aktivität wurde mit immunvermittelter Gewebeschädigung und -remodellierung bei chronischer Entzündung und Autoimmunität sowie mit einer veränderten zytotoxischen Überwachung in Kontexten von Krebs und Virusinfektionen in Verbindung gebracht. Daher wird GZMB häufig als funktioneller Marker für die Aktivierung zytotoxischer Lymphozyten sowie als mechanistischer Knotenpunkt für die Untersuchung von Apoptose, der Biologie der immunologischen Synapse und Immunpathologie verwendet.

granzyme B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GZMB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

granzyme B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GZMB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GZMB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen granzyme B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GZMB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von granzyme B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des granzyme B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GZMB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.