GRAMD1B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408929-ACT

Das humane GRAMD1B kodiert ein GRAM-Domänen-haltiges, membranassoziiertes Protein, das an intrazellulärem Steroltransport und an der Organisation von Kontaktstellen zwischen endoplasmatischem Retikulum und Plasmamembran beteiligt ist. Über seine GRAM-Domänen-vermittelte Lipiderkennung und Rekrutierung in spezifische Membrankompartimente ist GRAMD1B mit der Cholesterinhomöostase, der Membranzusammensetzung sowie lipidabhängigen Signalprozessen verknüpft, die den vesikulären Transport und zelluläre Stressantworten beeinflussen. Veränderte GRAMD1B-Expression wurde in genomischen und transkriptomischen Studien in mehreren Krankheitskontexten berichtet, darunter Krebs und immunassoziierte Erkrankungen, was seinen Einsatz in mechanistischen Studien zu lipidstoffwechselgekoppelten Signalwegen unterstützt. Die funktionelle Untersuchung von GRAMD1B hilft zu klären, wie Sterolverteilung und die Dynamik von Membrankontakten die Regulation von Zellzuständen und die Ausgänge von Signalnetzwerken modulieren.

GRAMD1B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GRAMD1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GRAMD1B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GRAMD1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GRAMD1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GRAMD1B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GRAMD1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GRAMD1B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GRAMD1B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GRAMD1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.