GPR40 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401434-ACT

Humanes FFAR1 (GPR40) kodiert einen G‑Protein-gekoppelten Rezeptor für mittel- und langkettige freie Fettsäuren, der vorwiegend an Gq/11 koppelt und dadurch die Phospholipase‑C-Signalübertragung, die Mobilisierung von intrazellulärem Ca2+ sowie die nachgeschaltete Aktivität des PKC/MAPK-Signalwegs stimuliert. In der Biologie der pankreatischen Inseln verknüpft GPR40 die Nährstoff- bzw. Lipidsensorik mit der Modulation der glukosestimulierten Insulinsekretion und trägt außerdem zu lipidresponsiven Signalwegen in enteroendokrinen und anderen metabolisch aktiven Zelltypen bei. Veränderte FFAR1/GPR40-Aktivität wurde im Kontext von metabolischem Stress, einschließlich Adipositas und Typ‑2-Diabetes, untersucht, wobei fettsäuregetriebene Signalgebung das endokrine und inflammatorische Crosstalk beeinflussen kann. Als Membranrezeptor, der Lipidsignale mit transkriptionellen und sekretorischen Outputs integriert, wird FFAR1 häufig eingesetzt, um die Dynamik der GPCR-Signalübertragung, Second-Messenger-Antworten und die Regulation metabolischer Signalwege zu untersuchen.

GPR40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FFAR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPR40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FFAR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FFAR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPR40-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FFAR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPR40-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPR40-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FFAR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.