GPR20 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407471-ACT

GPR20 kodiert einen verwaisten G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor (GPCR) der Klasse A, der überwiegend mit neuronaler und neuroendokriner Biologie in Verbindung gebracht wird. Es wird angenommen, dass er rezeptorvermittelte Signalwege mitprägt, die die cAMP-Dynamik, die MAPK-Aktivität und nachgeschaltete Transkriptionsprogramme beeinflussen. Als membranständiger GPCR kann GPR20 die Zell‑Zell‑Kommunikation sowie stimulusabhängige Signalnetzwerke modulieren, die in relevanten zellulären Kontexten Differenzierung, Erregbarkeit und sekretorische Prozesse koordinieren. Veränderte GPCR-Signalisierung ist allgemein an neuropsychiatrischen und metabolischen Phänotypen beteiligt, wodurch GPR20 ein nützliches Ziel ist, um die Verschaltung von Signalwegen und rezeptorgesteuerte Regulationszustände zu untersuchen. Humanes GPR20 ist daher für mechanistische Studien der GPCR-assoziierten Signaltransduktion und für die Kartierung von Effekten in Gen-Netzwerken in krankheitsrelevanten Modellsystemen von Interesse.

GPR20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPR20-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPR20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPR20-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPR20-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPR20-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPR20-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPR20-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPR20-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPR20-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.