GPAM CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403961-ACT

Humanes GPAM (Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase, mitochondrial) katalysiert den initialen und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der de-novo-Glycerolipid-Synthese, indem es Glycerol-3-phosphat und langkettiges Acyl-CoA zu Lysophosphatidsäure umsetzt. Diese enzymatische Aktivität verknüpft den mitochondrialen Lipidumsatz mit der Bildung von Phosphatidsäure, dem Aufbau von Triacylglycerolen und einem umfassenderen Umbau von Phospholipiden und beeinflusst damit die Membranbiogenese und die Bildung von Lipidtröpfchen. GPAM wirkt an der Schnittstelle von Fettsäureverwertung und Energiehomöostase, mit nachgelagerten Effekten auf Signallipide und das Gleichgewicht metabolischer Netzwerke. Eine veränderte GPAM-Expression oder -Aktivität wurde mit Phänotypen einer dysregulierten Lipidstoffwechselregulation in Verbindung gebracht, die für hepatische Steatose, Insulinresistenz und kardiometabolische Risikopfadwege relevant sind, was GPAM zu einem geeigneten Knotenpunkt für mechanistische Studien in der Stoffwechselbiologie macht.

GPAM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPAM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPAM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPAM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPAM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPAM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPAM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPAM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPAM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPAM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.