GPAA1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411203-ACT

GPAA1 (Glycosylphosphatidylinositol‑Anker‑Anheftung 1) kodiert eine zentrale Untereinheit des GPI‑Transamidase‑Komplexes im endoplasmatischen Retikulum, der die Anheftung von Glycosylphosphatidylinositol‑(GPI‑)Ankern an neu synthetisierte Proteine katalysiert. Dieser Verarbeitungsschritt ermöglicht die korrekte Membranverankerung und den Transport vieler Zelloberflächenproteine, die an Signalübertragung, Adhäsion und Immunmodulation beteiligt sind, und verbindet GPAA1 mit der ER‑Proteinqulitätskontrolle und der Homöostase des sekretorischen Weges. Eine veränderte GPI‑Anker‑Biogenese kann die Zusammensetzung des Oberflächenproteoms stören und nachgeschaltete Prozesse wie rezeptorvermittelte Signalwege und Zell‑Zell‑Interaktionen beeinträchtigen. GPAA1 und verwandte Gene des GPI‑Anker‑Signalwegs werden im Kontext angeborener Glykosylierungsstörungen, neuroentwicklungsbezogener Phänotypen sowie zellulärer Stressantworten untersucht, die mit einer beeinträchtigten ER‑Prozessierung einhergehen.

GPAA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPAA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPAA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPAA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPAA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPAA1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPAA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPAA1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPAA1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPAA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.