GP78 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402346-ACT

AMFR codiert das humane GP78 (Rezeptor für den autokrinen Motilitätsfaktor), eine im ER verankerte E3-Ubiquitin-Ligase, die als zentrale Komponente der endoplasmatischen-Retikulum-assoziierten Degradation (ERAD) wirkt, indem sie fehlgefaltete Proteine zur proteasomalen Beseitigung ubiquitinyliert. GP78 kooperiert mit ER-Chaperonen und E2-Enzymen, um die Proteinkvalitätskontrolle, ER-Stressantworten sowie den Umsatz ausgewählter metabolischer und Signalregulatoren zu steuern. Über seine Funktionen in der ubiquitinabhängigen Proteostase und membranassoziierten Signalübertragung wurde die AMFR/GP78-Aktivität mit zellulären Anpassungsprogrammen in Verbindung gebracht, die Proliferation, Migration und inflammatorische Stresssignalwege beeinflussen. Eine Fehlregulation von ERAD und von Ubiquitin-Ligase-Netzwerken unter Beteiligung von GP78 wurde u. a. im Kontext der Krebsbiologie, neurodegenerativer Erkrankungen und metabolischer Krankheitsmodelle untersucht, in denen ein Ungleichgewicht der Proteostase einen beitragenden Faktor darstellt.

GP78 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AMFR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GP78 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AMFR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AMFR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GP78-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AMFR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GP78-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GP78-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AMFR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.