GODZ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403970-ACT

ZDHHC3, auch bekannt als GODZ, kodiert eine Palmitoyl-Acyltransferase der DHHC-Familie, die die S-Palmitoylierung zytosolischer Cysteinreste an Zielproteinen katalysiert und dadurch deren Membranassoziation, Transport, Stabilität und Signalausgabe reguliert. Diese Lipidmodifikation beeinflusst den vesikulären Transport sowie die Kompartimentierung von Rezeptoren und Kanälen und prägt damit synaptische und membrannahe Signalnetzwerke. Über seine Rolle bei posttranslationalen Modifikationen und der Proteostase wurde ZDHHC3 mit gestörter Zellkommunikation und Stressantworten in Verbindung gebracht, die häufig in der Krebs- und Neurobiologie untersucht werden. Daher wird ZDHHC3 oft daraufhin untersucht, wie eine palmitoylierungsabhängige Umgestaltung von Membran-Mikrodomänen die Aktivierung von Signalwegen und zelluläre Phänotypen beeinflusst.

GODZ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZDHHC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GODZ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZDHHC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZDHHC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GODZ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZDHHC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GODZ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GODZ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZDHHC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.