glypican-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400256-ACT

GPC3 kodiert Glypican-3, ein über einen Glycosylphosphatidylinositol-(GPI)-Anker befestigtes Heparansulfat-Proteoglykan, das an der Zelloberfläche sowie an der Schnittstelle zur extrazellulären Matrix lokalisiert ist. Glypican-3 moduliert die Verfügbarkeit und die Signalreichweite von Morphogenen und Wachstumsfaktoren und beeinflusst dabei Signalwege wie Wnt/β-Catenin, Hedgehog, FGF und BMP, um Zellproliferation, Zelladhäsion und Musterbildung während der Entwicklung zu regulieren. Eine veränderte GPC3-Expression wird mit fehlreguliertem Gewebewachstum und onkogenen Signalprogrammen in Verbindung gebracht und wird breit als kontextabhängiger Regulator in der Leberbiologie sowie in tumorassoziierten Zellzuständen untersucht. Diese Eigenschaften machen GPC3 zu einem nützlichen Ausgangspunkt, um heparansulfatabhängige Signalübertragung, Rezeptor-Ligand-Interaktionen und die mikroumgebungsabhängige Regulation von Wachstumsfaktorgradienten zu analysieren.

glypican-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

glypican-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen glypican-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von glypican-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des glypican-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.