Plasmide CRISPR d'Activation (m) Glucosidase IIα: sc-420442-ACT

Ganab code la sous-unité alpha de la glucosidase II, une enzyme clé du réticulum endoplasmique (RE) impliquée dans le traitement des glycannes N-liés, qui retire successivement des résidus glucose des glycoprotéines naissantes. Cette activité est essentielle au contrôle qualité du RE : elle soutient le cycle de repliement calnexine/calréticuline, la maturation des glycoprotéines et la dégradation associée au RE (ERAD) des protéines mal repliées. En façonnant la protéostasie, GANAB influence la production de la voie sécrétoire et des programmes d’adaptation au stress tels que la réponse aux protéines mal conformées (UPR). La perturbation ou la dérégulation des voies de traitement des glycoprotéines liées à GANAB a été associée à des phénotypes de mauvais repliement protéique et à une biologie pertinente pour la maladie, notamment dans les tissus à forte demande sécrétoire.

Glucosidase IIα Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ganab sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Glucosidase IIα Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ganab dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ganab, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Glucosidase IIα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ganab natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Glucosidase IIα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Glucosidase IIα dans les cellules tumorales présentant une expression de Ganab silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.