Plásmido CRISPR de Activación (h) GlcNAc kinase: sc-407809-ACT

NAGK codifica la cinasa humana de GlcNAc, una enzima citosólica que fosforila la N-acetilglucosamina a GlcNAc-6-fosfato, conectando la vía de rescate de GlcNAc con el metabolismo de las hexosaminas. Esta actividad contribuye a la generación de UDP-GlcNAc, un sustrato donador central para la glicosilación N- y O‑ligada y otros procesos dependientes de glicanos que regulan el plegamiento de proteínas, el tráfico intracelular y la transducción de señales. Al influir en la capacidad de glicosilación, NAGK puede afectar las respuestas celulares a la disponibilidad de nutrientes y al estrés, con efectos posteriores sobre programas de crecimiento y diferenciación celular. La desregulación del flujo por la vía de las hexosaminas y de la glicosilación es una característica recurrente en contextos de enfermedades metabólicas y proliferativas, lo que convierte a NAGK en un nodo útil para el interrogatorio mecanístico de vías.

GlcNAc kinase El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NAGK sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GlcNAc kinase El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NAGK en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NAGK, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GlcNAc kinase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NAGK y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GlcNAc kinase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GlcNAc kinase en células tumorales con expresión de NAGK silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.