GKLF/KLF4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421298-ACT

Mouse Klf4 (GKLF/KLF4) kodiert einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der die epitheliale Differenzierung, die Kontrolle des Zellzyklus und die Aufrechterhaltung der Zellidentität reguliert, indem er linienspezifische Transkriptionsprogramme koordiniert. KLF4 moduliert Signalwege, die mit Stammzell-Eigenschaften und Reprogrammierung verknüpft sind, darunter die Integration mit WNT/β‑Catenin-, TGF‑β/SMAD- und p53-abhängigen Stressantworten, und beeinflusst die Barrierefunktion sowie entzündliche Signalübertragung in Epithelgeweben. Abhängig vom zellulären Kontext stört eine veränderte Klf4-Expression das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung und kann zu einer dysregulierten Gewebehomöostase beitragen, die für onkogene Transformation, Fibrose und Wundheilungs-Phänotypen relevant ist. In Mausmodellen wird Klf4 häufig eingesetzt, um die Reprogrammierung somatischer Zellen, die Epithelbiologie und Transkriptionsnetzwerke zu untersuchen, die Pluripotenz und Differenzierung steuern.

GKLF/KLF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Klf4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GKLF/KLF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Klf4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Klf4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GKLF/KLF4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Klf4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GKLF/KLF4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GKLF/KLF4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Klf4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.