GFAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400130-ACT

La proteina acida fibrillare gliale (GFAP) è una proteina dei filamenti intermedi che definisce l’identità degli astrociti e contribuisce all’organizzazione del citoscheletro, alla stabilità meccanica cellulare e al rimodellamento dei prolungamenti nel sistema nervoso centrale. La dinamica della GFAP si intreccia con i programmi di reattività astrocitaria e con reti di segnalazione come JAK/STAT e MAPK, che modulano la gliosi, la neuroinfiammazione e le risposte di riparazione tissutale. Alterazioni dell’espressione della GFAP e dell’architettura dei filamenti sono associate a disfunzioni degli astrociti in condizioni neurologiche e neurodegenerative, e la GFAP è ampiamente utilizzata come indicatore molecolare dello stato di attivazione e della linea cellulare degli astrociti. La modulazione sperimentale della GFAP supporta studi sulla maturazione degli astrociti, sulle interazioni neurone–glia e sul rimodellamento del citoscheletro in risposta allo stress.

GFAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GFAP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GFAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GFAP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GFAP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GFAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GFAP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GFAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GFAP nelle cellule tumorali con espressione di GFAP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.