GCNT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410791-ACT

Humanes GCNT1 kodiert eine im Golgi-Apparat lokalisierte Glykosyltransferase, die durch Verzweigung O-gebundener N‑Acetylgalactosamin-Strukturen die Bildung von Core‑2- und Core‑4‑O‑Glykanen katalysiert und dadurch mucinartige Glykosylierungsmuster auf Zelloberflächen- und sezernierten Proteinen prägt. Durch die Umgestaltung der Glykanarchitektur beeinflusst GCNT1 die Zell‑Zell-Erkennung, die Präsentation von Selektin-Liganden und das Trafficking von Immunzellen und kann Signal-Mikroumgebungen modulieren, indem es Rezeptor- und Mucin-Glykoformen verändert. Die GCNT1-Aktivität trägt zur Reifung epithelialer und hämatopoetischer Glykoproteine bei und wird häufig im Kontext von Adhäsion, Entzündung und Immunregulation untersucht. Eine dysregulierte, GCNT1-abhängige O‑Glykosylierung wurde mit veränderten tumorassoziierten Glykan-Signaturen und krankheitsrelevanten Veränderungen von Zellinteraktions-Phänotypen in Verbindung gebracht.

GCNT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GCNT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCNT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GCNT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GCNT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCNT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GCNT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCNT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCNT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GCNT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.