GC-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403599-ACT

OLFM4 (Olfactomedin 4), auch bekannt als GC-1, kodiert ein sezerniertes Glykoprotein, das im Gastrointestinalepithel und in hämatopoetischen Kompartimenten angereichert ist, wo es Untergruppen von Stamm- und Vorläuferzellen markiert. OLFM4 trägt zur epithelialen Homöostase bei, indem es Zelladhäsion, Differenzierung und angeborene Immun-Signalwege moduliert, und steht funktionell mit Wnt/β-Catenin-assoziierten Programmen sowie entzündlichen Signalwegen in der intestinalen Nische in Verbindung. Veränderte OLFM4-Expression wurde bei entzündlichen Darmerkrankungen und bei mehreren Malignomen beschrieben, wo OLFM4 häufig als kontextabhängiger Regulator von Proliferation, Überleben und Gewebeumbau untersucht wird. In humanen Systemen wird OLFM4 breit eingesetzt, um zelluläre Zustände zu stratifizieren und Mechanismen zu untersuchen, die die Barrierefunktion und tumorassoziierte Phänotypen steuern.

GC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen OLFM4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des OLFM4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der OLFM4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GC-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native OLFM4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GC-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GC-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem OLFM4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.