GATA-6 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420498-ACT

Das murine Gen Gata6 kodiert den Zinkfinger-Transkriptionsfaktor GATA-6, einen schicksalsbestimmenden Regulator der endodermalen Entwicklung und der epithelialen Differenzierung in Geweben wie Lunge, Pankreas, Darm und Herz. GATA-6 bindet an GATA-Motive in Enhancern und Promotoren, um Genprogramme zu koordinieren, die an Morphogenese, Zellschicksalsfestlegung und der Aufrechterhaltung differenzierter Zustände beteiligt sind, und integriert dabei häufig Signale aus Wnt-, BMP/TGF-β-, FGF- und Notch-assoziierten Netzwerken. In der Erwachsenenbiologie wird eine veränderte GATA-6-Aktivität mit fehlregulierter Differenzierung und Umbauprozessen in Verbindung gebracht, die die Organhomöostase und Stressantworten beeinflussen. Abweichende Expressionsmuster wurden unter anderem im Zusammenhang mit angeborenen Fehlbildungen und onkogener transkriptioneller Umprogrammierung untersucht, wodurch Gata6 ein nützlicher Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen entwicklungs- und krankheitsrelevanter genregulatorischer Schaltkreise ist.

GATA-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Gata6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GATA-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Gata6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Gata6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GATA-6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Gata6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GATA-6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GATA-6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Gata6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.