GalNAc-T6 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-431525-ACT

Galnt6 kodiert die Polypeptid‑N‑Acetylgalactosaminyltransferase 6 (GalNAc‑T6), ein im Golgi-Apparat lokalisiertes Initiationsenzym der mucinartigen O‑Glykosylierung, das GalNAc auf Ser/Thr‑Reste sekretierter und membranständiger Proteine überträgt. Durch die Etablierung von O‑Glykanstellen auf Muzinen und anderen Glykoproteinen beeinflusst GalNAc‑T6 die Proteinfaltung, die Anfälligkeit gegenüber Proteasen, die Organisation von Rezeptoren sowie Interaktionen mit der extrazellulären Matrix, welche Zelladhäsion, Motilität und Signaltransduktion prägen. Veränderte O‑Glykosylierungsmuster sind häufig mit epithelialem Remodeling und entzündlichen Mikroumgebungen verknüpft, wodurch Galnt6 ein relevanter Knotenpunkt für die Untersuchung der Regulation des Glykoproteoms in krankheitsassoziierten Kontexten ist. In Mausmodellen kann die Modulation der Galnt6‑Aktivität genutzt werden, um zu untersuchen, wie die Initiation der O‑Glykosylierung die Gewebehomöostase und die Reaktionsfähigkeit von Signalwegen beeinflusst.

GalNAc-T6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Galnt6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GalNAc-T6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Galnt6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Galnt6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GalNAc-T6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Galnt6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GalNAc-T6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GalNAc-T6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Galnt6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.