Plasmide CRISPR d'Activation (m) GalNAc-T6: sc-431525-ACT

Galnt6 code la polypeptide N‑acétylgalactosaminyltransférase 6 (GalNAc‑T6), une enzyme initiatrice de la O‑glycosylation de type mucine, résidente de l’appareil de Golgi, qui transfère des résidus GalNAc sur des résidus Ser/Thr de protéines sécrétées et membranaires. En établissant des sites de O‑glycanes sur les mucines et d’autres glycoprotéines, GalNAc‑T6 influence le repliement des protéines, leur sensibilité aux protéases, l’organisation des récepteurs et les interactions avec la matrice extracellulaire, qui façonnent l’adhérence cellulaire, la motilité et la transduction du signal. Des profils de O‑glycosylation altérés sont fréquemment associés au remodelage épithélial et à des microenvironnements inflammatoires, faisant de Galnt6 un nœud pertinent pour étudier la régulation du glycoprotéome dans des contextes liés aux maladies. Dans des modèles murins, la modulation de l’activité de Galnt6 peut servir à examiner comment l’initiation de la O‑glycosylation affecte l’homéostasie tissulaire et la réactivité des voies de signalisation.

GalNAc-T6 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Galnt6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GalNAc-T6 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Galnt6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Galnt6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GalNAc-T6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Galnt6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GalNAc-T6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GalNAc-T6 dans les cellules tumorales présentant une expression de Galnt6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.