GADD 45β CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401286-ACT

GADD45B (GADD45β) ist ein stressinduzierbares Mitglied der Familie der wachstumsarrest- und DNA-schadensinduzierbaren Proteine (GADD45), das genotoxische, entzündliche und metabolische Signale integriert, um Entscheidungen über das Zellschicksal zu modulieren. Es ist an der DNA-Schadensantwort und an reparaturassoziierter Signalübertragung beteiligt, ist mit MAPK-Signalwegen (einschließlich JNK und p38) sowie NF-κB-regulierten Programmen verknüpft und kann die Zellzykluskontrolle, Apoptose und die zelluläre Anpassung an Stress beeinflussen. In menschlichen Zellen wurde eine dysregulierte GADD45β-Expression mit veränderter Stresssignalgebung und transkriptionellen Antworten in unterschiedlichen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, darunter Krebsbiologie und immunassoziierte Pathologien. Diese Eigenschaften machen GADD45β zu einem nützlichen molekularen Knotenpunkt, um das Crosstalk zwischen DNA-Schadenssignalgebung, Entzündung und Überlebensprogrammen zu untersuchen.

GADD 45β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GADD45B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GADD 45β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GADD45B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GADD45B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GADD 45β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GADD45B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GADD 45β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GADD 45β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GADD45B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.