Plasmide CRISPR d'Activation (m2) GAD-65: sc-420471-ACT-2

Le gène murin Gad2 code la glutamate décarboxylase 65 (GAD-65), une enzyme associée aux membranes qui convertit le L-glutamate en GABA, un neurotransmetteur inhibiteur, contribuant ainsi à l’inhibition synaptique et à la stabilité des circuits neuronaux. La GAD-65 est particulièrement abondante dans les interneurones GABAergiques et régule, aux terminaisons présynaptiques, la synthèse de GABA dépendante de l’activité ainsi que l’approvisionnement vésiculaire en neurotransmetteur, établissant un lien entre le flux métabolique, la neurotransmission et la plasticité. Les altérations de la fonction de Gad2/GAD-65 sont largement utilisées comme point d’entrée moléculaire pour étudier l’équilibre excitation–inhibition et son implication dans l’épilepsie, les phénotypes liés à l’anxiété et au stress, ainsi que les troubles du neurodéveloppement. L’édition génétique ou les modèles murins ingénierés ciblant Gad2 permettent d’interroger de manière spécifique à certains types cellulaires les réseaux inhibiteurs, l’identité neuronale et le traçage de lignage, et de disséquer les mécanismes des voies de signalisation GABAergiques dans le cerveau.

GAD-65 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Gad2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GAD-65 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Gad2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Gad2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GAD-65. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Gad2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GAD-65 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GAD-65 dans les cellules tumorales présentant une expression de Gad2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.