Plasmide CRISPR d'Activation (h) GABA_A Rε: sc-405545-ACT

GABRE code la sous-unité ε du récepteur humain GABA\_A, un canal chlorure activé par un ligand qui assure une neurotransmission inhibitrice rapide dans le système nerveux central. L’incorporation de la sous-unité ε peut modifier le gating du récepteur, sa pharmacologie et la cinétique de désensibilisation, modulant ainsi l’excitabilité neuronale et l’inhibition synaptique. La signalisation du récepteur GABA\_A constitue un élément central des voies de canaux ioniques activés par des neurotransmetteurs, qui régulent le potentiel de membrane, les oscillations des réseaux et la plasticité dépendante de l’activité. Une altération du tonus GABAergique et de la composition en sous-unités du récepteur a été associée à des phénotypes neuropsychiatriques et liés aux crises, ce qui motive des études mécanistiques des fonctions spécifiques de chaque sous-unité.

GABAA Rε Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GABRE sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GABAA Rε Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GABRE dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GABRE, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GABAA Rε. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GABRE natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GABAA Rε au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GABAA Rε dans les cellules tumorales présentant une expression de GABRE silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.